心梗微环境适应性壳聚糖基水凝胶的研制及其性能评价

【摘要】在我国，心肌梗死的发病率和死亡率逐年攀升，并呈现年轻化的趋势。目前临床上主要以药物治疗和介入治疗为主，虽然能在一定程度上缓解症状，改善患者的生存质量，但是不能从根本上解决受损或梗死心肌的修复和重建，致使其死亡率居高不下。近年来发展细胞治疗策略，虽然在一定程度上可以修复受损心肌，但是由于无法改善恶劣的心梗微环境（缺血、缺氧、凋亡、炎症）致使其在心梗区的滞留率和存活率较低，长期效果不显著。随着材料科学、生命科学、医学和工程学的发展，以生物材料、种子细胞和生长因子为基本要素的可注射性心肌组织工程策略有望克服细胞移植策略的缺点，以期实现真正意义上的心肌修复与重建，已成为心肌梗死治疗研究的热点。在可注射心肌组织工程策略治疗心肌梗死的研究中，生物材料起着非常关键的作用，可以作为种子细胞的载体提高其在心梗区域的滞留和存活，促进受损心肌的修复与重建。但是，目前使用的可注射性生物材料，在设计时往往以提高材料的化学、物理以及加工性能为出发点而没有充分考虑心梗后缺血、缺氧的微环境。一方面，心梗后的组织缺血、缺氧会导致局部环境中产生大量的活性氧自由基（ROS），会造成细胞结构破坏甚至细胞死亡，影响心梗后的损伤修复。因此，有必要设计具有良好抗氧化能力的可注射水凝胶来抑制ROS导致的氧化应激损伤。最近已有一些可注射性抗氧化水凝胶用来修复受损皮肤和髓核组织，但在心肌组织工程研究中还未有报道。另一方面，梗死心肌的再血管化对于心梗修复是非常重要的，会影响移植细胞和宿主细胞的存活、增殖和成熟。目前常通过材料携带或直接注射血管形成相关的细胞和/或生长因子来促进心梗区的血管新生。但是，直接注射细胞不利于细胞的滞留和存活，而且恶劣的微环境使生长因子的活性降低进而影响其治疗效果，同时昂贵的价格也限制生长因子的应用。因此，研发出能在低氧微环境下促进血管生成的可注射性生物材料具有十分重要的意义。壳聚糖是具有良好生物相容性的天然氨基多糖，常被用作可注射性水凝胶材料。因其分子链上的活性基团而具备一定的抗氧化能力和一定的促血管形成能力。但是，一方面高分子量的壳聚糖由于分子间和分子内较强的相互作用力使其抗氧化活性较弱，而相低分子量的壳聚糖又难以形成均一稳定的凝胶；另一方面，壳聚糖虽然具有促血管生成活性，但是其在心梗微环境下的能力还显不足。所以如何使高分子量壳聚糖拥有良好的抗氧化性能和在心梗微环境下的促血管形成能力是基于壳聚糖水凝胶的可注射性心肌组织工程面临的主要难题。众所周知，谷胱甘肽（GSH）是一种重要的天然抗氧化剂。但分子量低，热稳定性差，因而生物效能受到影响。为此，研究人员将GSH接枝到高聚物分子上来增强它的稳定性和理化性能。RoY是一种可以促进血管内皮细胞生物学功能的合成多肽，注射入动物缺血组织中呈现出良好的促血管形成能力。RoY通过与低氧条件下细胞表面的GRP78受体结合进而激活相关信号通路来促进血管生成。因此，将具有血管生成活性的RoY接枝到壳聚糖大分子上具有一定的应用潜能，有望提高低氧环境中的血管生成活性，尚未见有相关报道。针对以上分析，本研究从调控心梗微环境的目的出发，以期研制出具有抗氧化、在心梗微环境下促血管生成的新型可注射性生物材料。为此，本研究主要从以下两个方面开展相关工作：第一部分壳聚糖-谷胱甘肽抗氧化水凝胶的研制及其性能评价实验一：氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物的研制及其性能检测。首先采用EDC化学法将GSH连接到高分子量的CSCl分子链上，合成不同取代度的CSCl-GSH复合物。分别通过氢谱核磁、红外光谱、热差分析跟踪CSCl-GSH的形成。通过研究其清除不同类型ROS（超氧自由基、羟自由基、有机氧自由基）的能力来评价其抗氧化性能，并分析复合物的取代度及浓度与抗氧化能力之间的内在关系。结果显示，GSH以共价键的形式接枝到CSCl分子的氨基上，可以通过改变CSCl与GSH的投料比、EDC用量来调控CSCl-GSH复合物的取代度。此外，CSCl-GSH复合物具有良好的热稳定性，热降解温度随取代度的增加而升高。同时复合物抗氧化性能良好，对各种ROS的清除能力均随浓度的提高而提高；对于不同类型的ROS，取代度对清除效果的影响有所不同，高取代度的复合物有利于对超氧自由基和DPPH有机氧自由基的清除，理论取代度为10%的复合物清除羟自由基的效果最佳。实验二：氯化壳聚糖-谷胱甘肽水凝胶的研制及其性能评价。在实验一的基础，以CSCl-GSH复合物为基材制备了温敏性的水凝胶，分别评价了CSCl-GSH水凝胶的粘度、降解性能和毒性。然后以心肌细胞为对象，考察了心肌细胞在水凝胶表面的粘附性能、在水凝胶内部的存活与形态，评价了CSCl-GSH水凝胶的生物相容性。结果发现，在CSCl-GSH复合物溶液中通过加入β-甘油磷酸钠形成了温敏性的可注射性水凝胶，室温下为可流动的液态，当温度高于36℃时迅速形成凝胶，GSH的引入有利于增强水凝胶的温敏特性。相比于CSCl水凝胶，CSCl-GSH水凝胶能够支持心肌细胞的粘附和存活，具有良好的生物相容性。实验三：ROS环境下氯化壳聚糖-谷胱甘肽水凝胶调控心肌细胞生物学行为的研究。通过过氧化氢（H2O2）构建体外ROS微环境，观察培养在CSCl-GSH水凝胶中的心肌细胞存活情况。然后从以下三方面综合评价H2O2条件下CSCl-GSH水凝胶对心肌细胞氧化应激水平的调控作用。（1）通过DHE、DCFH-DA染色和NO含量测定，考察水凝胶对细胞内超氧自由基、总ROS以及NO水平的影响。（2）通过检测过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的酶活力来评价水凝胶中细胞的抗氧化能力。（3）通过检测丙二醛含量，评价水凝胶对细胞内脂质氧化水平的影响。此外，通过Westernblotting实验检测caspase3活化水平，分析评价H2O2条件下水凝胶对心肌细胞凋亡的影响。结果表明，在H2O2构建的ROS条件下，生长在CSCl-GSH水凝胶中的心肌细胞存活状态良好。与CSCl水凝胶相比，在高浓度H2O2微环境中CSCl-GSH水凝胶可以有效地清除心肌细胞内各种自由基，取代度越高，清除效果越明显。在减少了细胞内ROS的基础上，CSCl-GSH水凝胶可降低细胞内抗氧化酶活力。同时CSCl-GSH水凝胶可降低细胞内因ROS反应生成的丙二醛含量，降低了脂质氧化水平，减轻了氧化应激损伤。此外，CSCl-GSH水凝胶通过减少caspase3的活化抑制了心肌细胞的凋亡。第二部分：具有促血管形成功能的壳聚糖-RoY水凝胶研制及其性能评价实验一：氯化壳聚糖-RoY水凝胶的研制及表征。本实验利用EDC化学法将RoY多肽与氯化壳聚糖大分子相结合，合成CSCl-RoY复合物。通过调整RoY与CSCl的投料比、EDC用量来调控复合物中RoY的取代度。通过氢谱核磁、红外光谱、热差分析对CSCl-RoY复合物的分子结构进行表征。在此基础上，制备了CSCl-RoY水凝胶，分析了水凝胶的体外降解行为。结果显示，RoY通过酰胺键的形式接枝到CSCl分子链上，通过改变CSCl与RoY的投料比合成了不同取代度的CSCl-RoY复合物，热稳定性良好。制备的CSCl-RoY水凝胶具有良好的温敏性，且降解速率明显低于CSCl水凝胶。实验二：氯化壳聚糖-RoY水凝胶对人脐静脉内皮细胞生物学行为的调控及相关机制研究。本实验以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为模型，系统研究在正常（21%O2）与低氧（3%O2）条件下CSCl-RoY水凝胶对HUVECs存活、增殖、迁移和成管腔能力的调控作用，并探索GRP78的表达、Akt和ERK1/2磷酸化水平，揭示CSCl-RoY水凝胶在低氧环境下影响HUVECs生物学行为的分子机制。结果说明，相对于正常O2条件和CSCl水凝胶，低氧条件下CSCl-RoY水凝胶更有利于HUVECs存活、增殖、迁移和形成管腔结构，且与RoY取代度有一定关系，低氧条件下，中、高取代度的CSCl-RoY水凝胶在提高细胞增殖活力和促管腔形成方面优于低取代度水凝胶，在促进细胞迁移方面，高取代度凝胶的优势最为明显。进一步的的实验表明，在低氧环境中，相对于CSCl水凝胶，在CSCl-RoY水凝胶中HUVECs的胞膜GRP78相对下调，同时Akt和ERK1/2的磷酸化水平相对提高。说明CSCl-RoY水凝胶可在低氧微环境下调节HUVECs胞膜表面的GRP78受体表达，激活与细胞存活、增殖相关的Akt和ERK1/2信号通路，从而促进HUVECs的存活、增殖、迁移等生物学行为。实验三：氯化壳聚糖-RoY水凝胶对大鼠心梗区血管形成及心梗修复的影响。本实验将PBS、CSCl和CSCl-RoY水凝胶注射入大鼠心梗区域，通过H&E、Masson三色染色以及血管特异性抗体免疫荧光染色，比较各组间的相对心梗面积、室壁厚度、微小血管密度与直径，研究CSCl-RoY水凝胶对心肌损伤、修复以及心梗区血管形成的影响。结果表明，相对于PBS和CSCl水凝胶，CSCl-RoY水凝胶能够明显增加心梗区微小血管的密度，一定程度增加血管直径，说明其具有较好的促血管生成能力。同时注射CSCl-RoY水凝胶使心梗区保留了更多的心肌纤维，存在有更多血管组织。CSCl-RoY水凝胶能明显减少心梗面积、一定程度增加室壁厚度。综上所述，本研究将GSH共价连接到高分子量的CSCl上，合成抗氧化能力可调的CSCl-GSH复合物，克服了高分子量壳聚糖抗氧化能力弱的缺点。在此基础上制备了具有优良温敏性能CSCl-GSH水凝胶，该水凝胶不仅能支持心肌细胞的粘附，而且在ROS微环境下，可有效消除心肌细胞内ROS，减少细胞的氧化应激损伤与凋亡。另一方面，将拥有低氧条件下血管生成活性的RoY接枝到CSCl大分子链上，并制备温敏性的CSCl-RoY水凝胶。其可以影响HUVECs表面的GRP78受体表达，激活与存活、增殖相关的Akt、ERK1/2信号通路，最终促进HUVECs的存活、增殖、迁移和管腔形成。此外，还可促进体内心梗区域血管的生成，减少心肌损伤、增进组织修复。由此可见，这两种心梗微环境适应性壳聚糖基水凝胶具有治疗心肌梗死的应用潜能。
【作者】舒瑶；
【导师】王常勇；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】抗氧化；心肌组织工程；心梗微环境；多肽；血管生成；

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